保健食品微生物检测方法(一)
保健食品微生物限度检查标准操作程序
保健食品微生物限度检查标准操作程序
一、目 的：建立微生物限度检查的基本操作规程，为微生物检查人员提供正确的操作规程。
二、适用范围：适用于品质管理部化验室的微生物限度检查。
三、职 责：品质管理部微生物检验人员对本标准的实施负责。
四、正 文：
1 定义：微生物限度检查法：系指非规定灭菌制剂及其原辅料受到微生物污染程度的一种检查方法，包括染菌量及控制菌的检查。
2 实验用具： 电热恒温培养箱、电热恒温水温箱、试管、刻度吸管、量筒、三角瓶、培养皿、试管架、注射器、 针头、注射器盒、研钵、75%酒精棉球、紫外灯（365nm 波长）。
3 培养基：
3.1 营养琼脂培养基、孟加拉红培养基、乳糖胆盐培养基、蛋白胨水培养基。
3.2 培养基的管理、配制应符合检定菌、培养基管理规程、培养基配制规程。 4 试液：甲基红试液、a-奈酚乙醇试液、40%氢氧化钾溶液、靛基质试液。 5 稀释剂：0.9%无菌氯化钠溶液。
6 供试品溶液的制备：取供试品（供试品如为固体，置研钵中研磨成细粉）放入试管中，加入 适量的稀释剂制成 1：10 浓度的供试品溶液。 7 对照用菌液：控制菌检查均应作相应已知菌的对照试验，对照菌株为大肠杆菌[CMCC（B）441022]。
取相应菌株的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物1白金耳，接种至营养肉汤培养基内，培养18-20小时，稀释至 1：106，对照菌的加入量为 50-100 个。 8 检查法：
8.1 除另有规定外，细菌的培养温度为 30-35℃，霉菌的培养温度为 25-28℃，控制菌的培养温度为 35±1℃。
8.2细菌、霉菌计数：
8.2.1 平皿菌落计数法 取均匀供试液，进一步稀释成 1：102、1：103 等
适宜的稀释级。分别取连续三级10倍稀释的供试液各1ml，置直径约 90mm 的平皿中，再注入约45℃的培养基约 15ml，混匀，等凝固后，倒置培养，每个稀释级应作2~3个平皿。营养琼脂培养基用于细菌计数，玫瑰红钠琼脂培养基用于霉菌计数。
8.2.2 菌数测定阴性对照试验 取供试验用的稀释剂各1ml，置4个无菌平皿
中，分别按细菌、 霉菌计数用的培养基制备平板，培养，检查，不得
长菌。
8.2.3 细菌培养时间为48小时，分别在24小时及48小时点计菌落数，一般以48小时菌落数为准， 霉菌培养时间为72小时，分别在48小时及72小时点计菌落数，一般以72小时菌落数为准。菌落如蔓延生长成片，不宜计数。
8.2.4 点计后，计算各稀释级的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。
8.2.5 菌数报告规则：细菌宜选取平均菌落数在30-300之间的稀释级，霉菌宜选取平均菌落数30-100之间的稀释级，作为报告菌数计算的依据。如只有1个稀释级菌落数在 30-300（30-100）之间时，将该稀释级的菌落数乘以稀释倍数报告，如同时有两个稀释级在 30-300（30-100）之间时，按下式计算两级比值。
比值 = 高稀释级平均菌落数×稀释倍数
低稀释级平均菌落数×稀释倍数
当比值≤2 时，以两稀释级的均值报告，当比值＞2 时以低稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告，如同时有3个稀释级的平均菌落数均在30-300（30-100）之间时，以后两个稀释级计算级间比值，如各稀释级的平均菌落数均不在 30-300（30-100）之间，以最接近30或300的稀释级平均菌数乘以稀释倍数报告，如各稀释级平均菌落数均在 300（100）以上，按最高稀释级菌落数乘以稀释倍数报告，如各稀释级平均菌落数均小于 30 时，
一般按最低稀释级的菌落数乘以稀释倍数报告，如当 1：10（1： 100）稀释级平均菌落数等于或大于原液（或 1：10）时，应以培养基稀释法测定，按测定结果报告菌数。
8.2.6 培养基稀释法：取供试液（原液或1：10供试液）3份，每份各1ml，分别注【保健食品微生物检测方法】
入5个平皿内（每皿各0.2ml）每个平皿中倾注营养琼脂培养基约15ml，混匀，凝固后倒置培养，计数，每1ml注入的5个平板点计的菌落数之和即为每1ml的菌落数，共得3组数据，以3份供试液菌落数的平均 值乘以稀释倍数报告。
如各稀释级平板均无菌落生长，或仅最低稀释级平均菌落数小于1时，则报告菌数为小于10个。
8.3 控制菌检查 除另有规定外，取供试液 10ml（相当于供试品1g、1ml、cm2），直接或处理后接种，经增菌、分离培养后，进行革兰氏染色、生化试验等项检查。
8.3.1 大肠菌群：
8.3.1.1 检样稀释及培养【保健食品微生物检测方法】
① 以无菌操作，将检样25g（ml）放于含有225ml灭菌生理盐水的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠），经充分振摇或研磨做成1：10的均匀
稀释液。固体检样在加入稀释液后，最好在均质器中以8000—10000r/min 的速度处理 1min，作成 1：10 的均匀稀释液。
② 用1ml灭菌吸管吸取 1：10 稀释液 1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水的试管内（注意吸管尖不要接触管内稀释液），混合均匀，做成1：100的稀释液。
③ 另取 1ml灭菌吸管，按上述操作顺序，做10倍递增稀释液。如此每次递增稀释一次，即换用一支1ml灭菌吸管。
④ 根据食品卫生标准要求或标本污染情况的估计，选择3个合适的稀释度，每个稀释度接种三管。
8.3.1.2 乳糖发酵试验
将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在 1ml 以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，1ml及1ml以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种三管，置36±1℃温箱内，培养24±2h，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进行。
8.3.1.3 分离培养
将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置 36±1℃温箱内，培养18~24h，然后取出，观察菌落形态，并做革兰氏染色和证实试验。
8.3.1.4 证实试验
在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落 1~2 个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置36±1℃温箱内，培养24±2h，观察产气情况。凡乳糖管产气，革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。
8.3.1.5 报告：根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每 100ml（g）大肠菌群的MPN值。
9 结果判断：
9.1 细菌菌落数、霉菌菌落数、控制菌三项均符合该品种微生物限度项下的规定，应判为供试品符合规定；其中任何一项不符合该品种项下规定，应判供试品不符合规定。【保健食品微生物检测方法】
9.2 细菌菌落数、霉菌菌落数第一次测定超过该品种项下微生物限度规定时，应从同一批号样品中随机抽样，复试两次，以三次结果平均值报告。
9.3 如营养琼脂培养基平板上生长霉菌菌落数或玫瑰红钠琼脂培养基平板上生长细菌菌落数超过该品种项下微生物限度规定时，经复试2次，如3次结果平均值仍超过规定，应判为供试品不符合规定。
9.4 各类制剂检出控制菌或其他致病菌时，按第一次检出结果为准，不再抽样复试，即应判该供试品不符合规定。
保健食品微生物检测方法(二)
保健功能食品卫生微生物学检验方法的探讨
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保健功能食品卫生微生物学检验方法的探讨 作者：王国琴
来源：《中国现代医生》2012年第33期
[摘要] 本文通过在培养基上具体实验，对17种保健（功能）产品进行了方法学方面的验证。深入研究保健（功能）食品微生物学在检验细菌、霉菌及酵母茵检查方法方面的合理性。以此来探讨目前我国微生物学验证方法的合理性。
[关键词] 微生物学检验；方法学验证；中国药典；食品安全
[中图分类号] R446.5 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2012）33-0069-02
目前我国食品卫生在保证保健（功能）食品的安全方面，普遍采用的是微生物学检验，按照我国目前的食品卫生管理条例[1]，我国保健食品卫生应该采用微生物学检验，因此，为了全面了解国标（GB/T4789—2003）[2]方法验证食品卫生微生物学检验是否具有合理性，研究人员依照《中国药典》（2005年版）[3]微生物学验证的相关要求入手研究，采用大肠杆菌和枯草杆菌在培养基里培养实验并且采取微生物检验方法，对我国生产的一些保健食品进行验证，其中包括各种型号的口服液、药丸、冲剂等等，来探讨保健（功能）食品卫生微生物学检验方法的重要性。通过几种实验的方法，有力地说明采用我国医药国家标准存在不完善的地方，同时对此提出一些合理的建议。
1 实验材料
1.1 实验样品
牙周康胶囊、感冒软胶囊、绅宁宝胶囊、天丹通络胶囊、斯达舒胶囊、白伺丸胶囊、天然培旦陛牌70无蜡蜂胶液、复方芦荟胶囊、清热暗疮胶囊、消炎灵胶囊、独一味胶囊、糖尿乐胶囊、植物降糖胶囊、蝮蛇木瓜胶囊、坤复康胶囊、京都念慈庵灵芝蜜、头孢地尼胶囊。
1.2 实验用培养基
实验用培养基包括酵母膏、葡萄糖培养基、高氏合成一号琼脂、酵母膏、蛋白胨琼脂、醋酸菌培养基、营养肉汁琼脂、固氮菌培养基、玉米粉培养基、乳酸菌培养基Ⅱ、蛋白胨。
1.3 实验用菌种
实验用菌种包括大肠杆菌、沙门氏菌、白色念珠菌、黑曲霉菌、福氏志贺氏和乙型溶血性链球菌。
2 实验方法及结果
保健食品微生物检测方法(三)
食品微生物快速检测技术应用分析
摘要：和传统的检测方法相比，食品微生物快速检测技术的应用实现了对食品微生物更加快速、灵敏以及准确的检测和鉴定。本文主要对当前应用比较广泛而且自身发展较为成熟的几种快速检测技术进行了分析和探讨，可供相关食品检测人员参考，使其能更好的完成食品微生物检测和鉴定工作。 关键词：食品微生物；快速检测技术
中图分类号：R194.2文献标识码：Ａ
众所周知，食品是人类赖以生存和发展的基础，而食品的安全问题的重要性是显而易见的，目前食品的安全已经得到了全社会甚至全世界的广泛关注。食品微生物快速检测技术和传统的检测技术相比具有很多的优点，因此得到了越来越广泛的应用和推广，通过快速检测技术的应用，可以实现对食品中各种微生物的快速检测，避免由于食源性而导致的疾病，保证人类的健康。本文对当前应用的较为广泛的食品微生物快速检测技术进行了分析和探讨，目的是希望用最快及最准确的方法检测食源性致病菌，进而保证人们生命的安全。
１免疫学技术
1.1免疫荧光技术
免疫荧光技术（Immunofluorescence technique ）又称荧光抗体技术。它是通过抗原抗体反应的高度特异性，在抗体（或抗原）上加入不影响抗原抗体活性的荧光色素标记，当与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应从而实现对细菌的检测和鉴别的技术。
该技术通常可以按照以下的操作步骤来完成检测。
1.1.1对接受检测的样本中的抗原或者抗体测定出来，使被检验的样本和酶标抗原或者是抗体结合在一起之后，根据相关要求中的步骤使其和固相载体的表面的抗原和抗体发生反应。
1.1.2通过洗涤将位于固相载体表面的抗原抗体分离出来，这时使得接受检测的样本的量和位于固相载体表面的酶量会以一定的比例结合在一起，然后在其中加入一定量的酶反应底物，这时经过催化剂的摧毁作用底物将会变成有色物质，有色产物和接受检测样本物质的多少之间有着密切的关系，这时就可以根据有色物质的颜色深浅来完成对接受检测样本的定量分析。该种检测方法的灵敏度较高，增菌之后样本在达到检出度需要的时间比较短，因此抗原和抗体在很短的时间之内就可以完成结合反应。
1.2酶联免疫吸附技术
该种技术是放射免疫技术和荧光技术的有机结合，酶联免疫吸附技术是固相载体通过对抗原和抗体的吸附并完成免疫酶染色，当底物有颜色显现出来之后然后对定量有色产物的分析进而将接受检测样本中的某些物质的具体含量确定出来。当前主要的分类方法有竞争法、捕获法、间接法以及夹心法。酶联免疫吸附技术具有很多优点，比如可以实现定量分析、适用范围广、反应灵敏准确、简单方便、检测费用低、检测速度高以及分析结果真实可靠等，该种技术可实现对数量较多的样品进行分析，数量可到上千种，正是因为该种技术具有如此之多的优点，在食品检测中得到了十分广泛的应用。
1.3免疫层析技术
免疫层析技术作为一种固相免疫测定技术，它的原理是在膜以便添加的样品在膜的毛细管的作用下朝另外一边移动和层析相似，在发生移动的过程当中某些抗原和抗体完成结合之后被固相化，在移动中除了结合物之外的物质将会被分离出来，根据标记物的颜色深浅来完成被测样本的定量分析。目前应用较为广泛的是胶体金免疫层技术，其就是通过胶体金来进行标记物的试验，具有很多的优点，比如准确、快速、简单以及无污染，可以实现对食品中霍乱弧菌、布氏杆菌、金黄色葡萄糖球菌、沙门氏菌以及大肠杆菌等的检测和鉴定。
1.4免疫磁珠技术
该种技术通过连接抗体的磁珠将增菌液中的目的捕捉出来之后在平板上将获得的目的菌进行观察分析，或亦可通过酶标记或者是荧光抗抗体来完成检测鉴定。目前可以通过该种技术来完成对大肠杆菌0111、0145、0157以及沙门氏菌的检测和鉴定。
2分子生物学
2.1基因芯片技术
基因芯片是生物芯片的一种，也就是DNA微探针阵列。基因芯片技术是通过对微电子技术和分子生物学的应用，使得被标记的基因探针和寡核苷酸点杂交之后，使用相关的检测系统实现对芯片的扫描，进而实现对被测样本中的微生物进行定量分析和鉴定。该种技术在一次试验中可以将接受检验样本中所有的潜在致病原以及其遗传性指标。在施工该种技术的时候，由于芯片检测的结构在很大程度上会受到样点自动识别的影响，因此基因芯片在进行处理数据以及提取信息的时候要确保对图像中所有杂交样点的准确定位。
2.2基因探针技术
该种技术是在一定的条件下使得2条可以实现互补的2条碱基DNA链完成互补之后形成具有稳定性的DNA，其原理是通过对接受检测的样品和DNA探针进行观测，看有没有杂交分子出现，进而实现对被检测样品中是否存在某种微生物的判断，如果有杂交分子出现即就是存在某种微生物，反之就没有。该种技术诞生于20个世纪90年代，该种技术在法国和美国等发达国家的食品微生物检测中已经得到了广泛的应用，加上现在的DNA指纹图谱自动分析系统中实现了对化学发光标志物的引进，可以更加简单方便的对获得的图谱和核酸碱基进行分析对比以实现对视频中微生物的定量分析和鉴定。
3代谢学
3.1阻抗法
阻抗法的原理是微生物在生长时培养基中的碘惰性底物经过代谢成为活性底物，这时培养基中的电导性就会增加以降低培养基中的阻抗，这对培养基中的电阻抗的具体变化情况进行检查分析就会完成对被检测样本微生物的检测鉴定。该种检测方法适用的范围广，在很多领域都得到了广泛的应用，其具有很多优点，比如特异性、高敏感性以及反映快速等。
3.2放射法
该种检测方法是将多种物理和化学诊断方法结合在一起的新的检测技术，其原理是在细菌生长的过程中通过培养基中的盐类底物或者是有碳标记的碳水化合物经过代谢之后产生一氧化碳，这时对产生的一氧化碳量进行测量分析，其量在原有碳水化合物的基础上一氧化碳量有没有增加来实现对被检测样本中的某种微生物细菌进行分析。该种检测方法具有很多优点，比如准确度高、速度快，更重要的是可以实现自动化检测。该种检测技术对各类物品的无菌检测都是非常适用的。 4干片法
该种方法是对微生物学、高分子学以及化学综合应用的检测方法，其原理是通过无毒的高分子材料作为培养基载体进而准确快速的完成对食品中各种微生物的定量分析，该种方法已经成为一种定量的常规方法。该种方法可以保证测定的精确度，对于少量样品的检查无需配置试剂，因此操作起来简单方便、费用低、携带方便而且不会受到时间的限制，除此之外该种方法没有任何废弃物产生，所以不会给环境带来污染，由此可见该种方法具有较强的适用范围，可以在很大程度上减少工作人员的工作量，而且还可以保证检测的质量。
5PCR技术
该种检测技术的原理将目的菌高度保守段的具有特异性的DNA进行大量的复制并对这些DNA进行检测分析，假如在样品汇总有目的菌存在就将有关特异性的DNA复制出来，对具有特异性DNA复制通过聚合酶链反应就是PCR技术。目前PCR技术在食品的微生物检测中已经得到了广泛的应用，而且已经形成了标准化，得到很多权威机构的认可，该种检测技术具有速度快、精度高、污染小、一级自动化程度高等优点，可以实现对单增李斯特菌、大肠杆菌O157、阪崎肠杆菌以及沙门氏菌等1 000多种细菌的检测鉴定。
6直接表面荧光滤膜计数技术
该种检测技术可以直接将被测样本中微生物负荷量测定出来，最开始研究开发该技术是为了对牛奶样品进行检测，当前该种检测方法在肉类制品、乳制品以及饮料等物质的检测中都得到了广泛的应用。该技术通过表面荧光显微镜以及膜技术的使用时限对样本的培养之后通过DEFTT来完成计数。通过该中技术可以对5℃和11℃条件下保存的巴氏杀菌乳的质量进行检测分析，而且完成每一个样品的检测不到半个小时的时间，而且检测需要的费用较少。随着直接表面荧光滤膜计数技术的不断发展，目前可以实现对苹果汁以及蔬菜等的大肠杆菌的检测和鉴定，此技术不但能通过膜过滤实现对食品中微生物的收集并在膜的表面浓缩，而且能通过表面荧光显微镜实现荧光抗体的染色。通过该种方法和别的方法分析的结果是一致的，由此可见该种方法作为李氏杆菌数量测定方法是合理可行的。
7食品微生物快速检测技术的不足
通过以上的分析和评估，不同的食品微生物检测技术都有着自己的优点以及使用范围，很多快速检测技术对于某种食品检测性能会比其他食品更加优良，这主要是因为食品自身的成分导致的，有些食品中的一些成分在使用食品微生物快速检测技术是很麻烦的，需要考虑到很多的因素，食品中的有些成分会直接影响检测的结果，因此要引起重视，以确保检测的准确性。
8结束语
综上所述，由于快速检测技术具有很多的优点，因此越来越多的应用到了食品的微生物检测和鉴定当中，这也在很大程度上促进了快速检测技术的发展和进步。由于每一种检测技术都有一定的适用性，因此不管是企业还是检测鉴定中心，在选择微生物快速检测技术的时候，要结合多种因素进行考虑，要做到以最少的时间和花费实现对食品微生物的快速检测和鉴定。这就需要不断完善科研管理体系，同时要不断提高检测队伍的综合实力，当然还要保证加大科研经费的投入以确保检测鉴定仪器的先进性，并能及时掌握国际的先进信息，以便于及时掌握一些先进的检测鉴定技术，更好的完成对食品微生物的检测和鉴定，以保证人们生命的安全。
参考文献
［1］闫雪，姚卫蓉，钱和．国内外食品微生物快速检测技术应用进展［J］．食品科学，2005（06）．
［2］熊强，史纯珍，刘钊．食品微生物快速检测技术的研究进展［J］．食品与机械，2009（０5）．
［3］蔡扬尧，陈永杰．食品微生物快速检测技术应用的探讨［J］．商品与质量：学术观察，2012（０4）．
［4］陈庆森，冯永强，黄宝华，魏国祥，庞广昌，胡志和．食品中致病菌的快速检测技术的研究现状与进展［J］．食品科学，2003（11）．
［5］陈超敏，陈继道．浅谈食品微生物检测技术的应用［J］．科技与企业．2012（０6）．
［6］杨平，杨迎伍，陈伟，王国民，李正国．食品中4种致病微生物的多重PCR快速检测技术研究［J］．西南大学学报（自然科学版），2007（０5）．
［7］刘道峰，邓省亮，赖卫华．新型层析快速检测技术及其在食品安全中的应用［J］．食品与机械，2011（０6）．
［8］郑东宏．食品微生物检验新方法简介［Ｊ］．广州食品工业科技，2004（０6）．
［9］邱伟芬．酶联免疫吸附分析及其在食品安全检测中的应用［Ｊ］．粮食与饲料工业，2004（０3）
http://m.zhuodaoren.com/tuijian363386/
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