被动凝集法的优缺点(一)
肺炎支原体核酸荧光PCR法与血清 被动凝集法的比对分析
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肺炎支原体核酸荧光PCR法与血清 被动凝集法的比对分析
作者：舒美莲
来源：《延边医学》2014年第18期
摘要：目的：探讨肺炎支原体核酸荧光PCR法与血清学抗体检测—被动凝集法的比对关系。方法：将有咳嗽、低热、X线胸片检查有肺纹理增粗的急性上呼吸道感染的0—12岁的患儿700例分别获取咽拭子进行核酸荧光PCR法检测和静脉抽血进行血清学抗体检测。结果：上述700例患儿中，肺炎支原体核酸荧光PCR法阳性率和灵敏度在0—4岁阶段明显高于血清学检验，4—12岁阶段阳性率低于血清学检验但特异性明显高于血清学检验。结论：核酸荧光PCR法具有早期、快速、特异等优点，血清被动凝聚法灵敏度和特异性都较低，特别是婴幼儿免疫系统还未发育完善，产生抗体的速度较慢，抗体量不够，易产生假阴性。
关键词：肺炎支原体 荧光PCR检测 血清学抗体检测 被动凝聚
Comparative Analysis OfMycoplasma PneumoniaeNucleic Acid Fluore
-scentPCRAnd SerumPassive Agglutination
Shu MeilianDepartment OfHunanProvinceYuanling County Hospital Of Traditional Chinese Medicine
Abstract:Objective: Discussion oninspection/Mycoplasma pneumoniaenucleic acid
fluorescentPCRandserum antibody ofPassive AgglutinationMethod relations.Method: There are 700cases of cough,fever,chest X-rayexamination isthe lung texture increasesacute upper respiratory tractInfectionofcoarseaged 0 to12years oldchildren,who got thepharynx swabs ofnucleic acidfluorescent PCR detectionandvenous bloodserumanti-body detection.Results: The above
700cases,Mycoplasma pneumoniae?DNAby fluorescent PCRpositive rate andsensitivity in0to 4 years oldstagewas higher than that ofserological test, 4to 12 years oldstagepositive rate of less【被动凝集法的优缺点】
thanserological testsbutthe specificity was higher thanseroLogiCaltest.Conclusions: Nucleic acid fluorescentPCR methodwith early,rapid,specific advantages. Serum passivecoacervationsensitivity and specificityare low,especially theinfantimmune systemdevelopment has not been perfect,antibody producingslower,antibodyis not enough,easy to producefalse negative.
Key words:Mycoplasma pneumoniae Fluorescent PCR detectionSerumantibody
detectionPassivecondensation
支原体是1898年Nocard等发现的一种类似细菌，但不具有细胞壁的原核微生物[I]，肺炎支原体是人类支原体肺炎的病原体。因其没有细胞壁，所以所有抑制细菌细胞壁合成的药物，其都表现为耐药，如青霉素，支原体能在无生命的人工培养基上生长繁殖，但其生长过程较
被动凝集法的优缺点(二)
被动凝集法检测肺炎支原体抗体的临床应用及流行病学分析
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被动凝集法检测肺炎支原体抗体的临床应用及流行病学分析【被动凝集法的优缺点】
作者：程云华
来源：《医学美学美容·中旬刊》2014年第01期
【摘要】目的：探讨被动凝集法检测肺炎支原体抗体的临床应用及流行病学分析。方法 对2012年11月～2013年10月在我院2038份疑似肺炎支原体感染者进行SERODIA-MYCO Ⅱ被动凝集法检测血清抗体，判断肺炎支原体感染者并分析其流行病学资料，包括总阳性率、年龄组差异、季节阳性率差异及不同标本来源阳性率差异等。结果 2038份临床疑似肺炎支原体感染者中，MP阳性405例，总阳性率19.9%，其中0～2岁，2～4岁，4～6岁，6～8岁，8～14岁，14～60岁，>60岁的各年龄段的阳性率分别为17.9%，28.2%，31.7%，37.7%，
15.5%，15.1%，7.3%，其中6～8岁组阳性率最高；不同季度MP阳性率分别为第一季度（1～3月），第二季度（4～6月），第三季度（7～9月），第四季度（10～12月）分别为23.9%，14.7%，14.5%，25.1%，第一、四季度总阳性率为24.5%，第二、三季度总阳性率为14.6%感染率，两者之间差异有统计学意义（X2=4.382，P【被动凝集法的优缺点】
【关键词】肺炎支原体；抗体；被动凝集法；临床应用；流行病学分析
【中图分类号】R446.6 【文献标识码】B【文章编号】1004-4949（2014）01-0095-01 肺炎支原体（mycoplasma pneumoniao，MP），是引起呼吸道感染的一种病原体，所引起的人类支原体肺炎病理变化以间质性肺炎为主，平时散在发病，主要经飞沫传染，在幼儿园、学校、家庭等流行。首先引起上呼吸道感染，然后下行引起气管炎、支气管炎、毛细支气管炎和肺炎，同时也可引起肺外并发症，如脑膜炎、脑干炎、脊髓炎等[1]。MP培养所需营养比一般细菌高，生长缓慢，培养时间长。而用SERODIA-MYCO Ⅱ被动凝集法检测血清肺炎支原体抗体，操作简单，3个小时就可以报告结果，为临床提供信息，及时治疗。
1材料与方法
1.1标本来源 2012年11月～2013年10月2038例来我院就诊的门诊及住院的急性呼吸道感染患者，其中男性患者932例，女性患者1106例，年龄11月～93岁。
1.2试剂和检测 日本富士瑞必欧株式会社产品，SERODIA-MYCO Ⅱ被动凝集法检测血清抗体。严格按照说明书进行操作：稀释待检血清标本、阴性和阳性对照分别加入U型板内，25ul/孔，再加入肺炎支原体致敏的明胶颗粒悬液，25ul/孔，振荡器混匀，避光，置室温3h后观察结果，结果的读取标准根据富士瑞必欧株式会社提供的凝集反应图卡进行。
1.3阳性结果的判定：血清肺炎支原体总抗体滴度≥1：80为阳性提示MP近期感染。
被动凝集法的优缺点(三)
肺炎支原体核酸荧光PCR法与血清 被动凝集法的比对分析
摘要：目的：探讨肺炎支原体核酸荧光PCR法与血清学抗体检测―被动凝集法的比对关系。方法：将有咳嗽、低热、X线胸片检查有肺纹理增粗的急性上呼吸道感染的0―12岁的患儿700例分别获取咽拭子进行核酸荧光PCR法检测和静脉抽血进行血清学抗体检测。结果：上述700例患儿中，肺炎支原体核酸荧光PCR法阳性率和灵敏度在0―4岁阶段明显高于血清学检验，4―12岁阶段阳性率低于血清学检验但特异性明显高于血清学检验。结论：核酸荧光PCR法具有早期、快速、特异等优点，血清被动凝聚法灵敏度和特异性都较低，特别是婴幼儿免疫系统还未发育完善，产生抗体的速度较慢，抗体量不够，易产生假阴性。 关键词：肺炎支原体 荧光PCR检测 血清学抗体检测 被动凝聚
Comparative Analysis OfMycoplasma PneumoniaeNucleic Acid Fluore
-scentPCRAnd SerumPassive Agglutination
Shu MeilianDepartment OfHunanProvinceYuanling County Hospital Of Traditional Chinese Medicine
Abstract:Objective: Discussion oninspection/Mycoplasma pneumoniaenucleic acid fluorescentPCRandserum antibody ofPassive AgglutinationMethod relations.Method: There are 700cases of cough,fever,chest X-rayexamination isthe lung texture increasesacute upper respiratory tractInfectionofcoarseaged 0 to12years oldchildren,who got thepharynx swabs ofnucleic acidfluorescent PCR detectionandvenous bloodserumanti-body detection.Results: The above 700cases,Mycoplasma pneumoniae?DNAby fluorescent PCRpositive rate andsensitivity in0to 4 years oldstagewas higher than that ofserological test, 4to 12 years oldstagepositive rate of less thanserological testsbutthe specificity was higher thanseroLogiCaltest.Conclusions: Nucleic acid fluorescentPCR methodwith early,rapid,specific advantages. Serum passivecoacervationsensitivity and specificityare low,especially theinfantimmune systemdevelopment has not been perfect,antibody producingslower,antibodyis not enough,easy to producefalse negative.
Key words:Mycoplasma pneumoniae Fluorescent PCR detectionSerumantibody detectionPassivecondensation
支原体是1898年Nocard等发现的一种类似细菌，但不具有细胞壁的原核微生物[I]，肺炎支原体是人类支原体肺炎的病原体。因其没有细胞壁，所以所有抑制细菌细胞壁合成的药物，其都表现为耐药，如青霉素，支原体能在无生命的人工培养基上生长繁殖，但其生长过程较慢，对临床早期诊断意义欠佳，小儿肺部感染是儿科临床常见病与多发病，其中肺炎支原体（MP）感染占有一定的比例，支原体肺炎的病理改变以间质性肺炎为主，具有病情重，病程长等特点，有些肺炎支原体感染者可进展为重症肺炎，并发心力衰竭，呼吸衰竭，中毒性脑病等危重病症，危及患儿生命[II]，近年来小儿肺炎支原体感染发病率显著增多，具有局部流行趋势，除引起以往认为的非典型肺炎外，还可引起肺外各系统的改变，受到了临床广泛的重视。所以及早有效的检测方法显得尤为重要
一、资料和方法
1.1选取2013年3月―2014年3月在我院门诊及住院的0―12岁急性上呼吸道感染的小儿患者700例分别采集咽拭子和静脉采血3ml离心待检。
1.2仪器与试剂
AB7500全自动荧光PCR仪及肺炎支原体核酸检测试剂盒。
平板混合器用于充分混均内容物，平板观测器用于判读结果及肺炎支原体抗体检测试剂盒。
1.3方法
1.3.1对患者用无菌棉拭子蘸取无菌生理盐水迅速擦拭两侧腭弓及咽、扁桃体取分泌物，将棉拭子置于无菌玻璃管密封送检，送检时应采用0度冰壶。标本可立即检测，也可存放于-20℃待检。标本基于Taqman探针实时荧光PCR技术，试剂盒中使用dutp和unG酶防止扩增产物的污染，仪器PCR程序运行完成后按仪器及软件要求进行结果数据分析，以取高于样本噪声线和阴性对照的荧光值作为检测阈值，以FAM通道ct值来判断肺炎支原体DNA的存在。
1.3.2肺炎支原体抗体检测采用被动凝集法，抗原是由肺炎支原体（Mac株）细胞膜成份致敏人工明胶粒子而成。本试验是基于如下原理，致敏粒子与人血清中存在的肺炎支原体抗体发生凝集反应。将待检血清呈梯度稀释，分别与致敏粒子与未致敏粒子发生抗原抗体反应，最后在平板观测器上读取凝集图像来判断阳性和阴性结果。
1.3.3 以上两种方法的阳性率，灵敏度，特异性列表如下：
表1：700例0-12岁小儿肺炎支原体检测结果
表2：
1.4应用spss13-0统计软件，计量资料以（X±S）表示，结果采用t检验，计数资料采用X?检验。PC<0.05示差异有统计学意义。
二、结果
在上述700例急诊肺部感染的患儿中，我院临床医师根据试验结果和患者临床症状进行综合评估，最后临床确诊为肺炎支原体感染的患儿实际人数为100人，全部治愈，无死亡病例。其中通过核酸荧光PCR法检测阳性人数为87人，真阳性人数为85人，灵敏度达到了85%、特异性达到96%，而血清被动凝集法检出阳性人数为103人，而真阳性人数为70人，灵敏度仅为70%、特异性仅为69%，这说明血清被动凝集法有一定比例的假阳性，特别是0-1岁患儿的检出率明显偏低。
三、讨论
通过对以上700例急性肺部感染的0-12岁小儿患者进行肺炎支原体检测结果比对分析，我们发现肺炎支原体荧光PCR检测的灵敏性，特异性明显高于血清学，特别是婴幼儿，且与其他支原体无交叉反应，不受口腔其他菌干扰，所需时间短，而被动凝集法是检测血清中的特异性抗体，抗原刺激机体后，在血清中能测到特异抗体前，有一个潜伏期，此期的长短由抗原的性质，抗原进入机体的途径，所用佐剂类型及宿主情况所决定，可短致3小时，也可长至几星期[III]。婴幼儿由于免疫系统还未发育完全，对抗原的识别能力还不够，所以用血清学方法来测定会有一定的漏诊，假阴性。严重的支原体肺炎可引起死亡，因此选择更加特异的检测方法，对于支原体肺炎的准确性防治有十分重要的意义，争取早日诊断，以指导临床用药，核酸PCR法肺炎支原体感染1-2天内就可得以确诊。血清被动凝聚法检测时，极低的抗体不能被此试验检测出来，抗体如果过高的样品在检测时会出现前带现象，也都会造成假阴性。特别是一些婴幼儿其免疫系统还不够完善，对进入机体的异物不产生或产生极低的相应抗体，进行该试验时可能会出现假阴性，另外一些服用了免疫抑制和免疫缺陷的患者也可能出现假阴性，总而言之，采用荧光PCR方法检测肺炎支原体DNA，可具有早期、快速、准确等优点。如果将荧光PCR法和血清学检测相结合，则可以大大提高阳性检出率，更好的服务于临床。
参考文献:
[1]叶应妩王硫三田子瑜等全国临床检验操作规程P988
[2]羊礼荣小儿肺炎支原体感染368例临床分析 [I]家用临床医药杂志2011,15（17）；1001-1003，3陈慰峰，医学免疫学M，第4版，人民卫生出版社，P166
[3]陈慰峰金伯泉 医学免疫学[M] 人民卫生出版社，P166
被动凝集法的优缺点(四)
免疫培养―凝集法快速检出痢疾杆菌的试验
摘要：目的 建立免疫培养-凝集法的快速检出痢疾杆菌方法，为疫情流行病学调查处理和患者早期诊断治疗提供病原学依据。方法 将经大肠杆菌吸附后的福氏和宋内氏混合抗血清加入GN增菌肉汤培养液中，混匀后滴加于玻片凹处，再将离心沉淀后的粪便样品上清液接种于该培养液中，放入湿盒37℃培养4～6h，取出并肉眼观察玻片凹处培养液中的凝集菌团，凡发现一个凝集菌团即为阳性。每份样品以常规细菌培养法做平行试验。吸取凝集菌团并以细菌培养法进行验证试验。 结果 共检测111份菌痢和腹泻患者粪便样品，免疫培养-凝集法检出阳性41份，检出率为36.9%，与细菌培养法检出阳性的符合率达89.2%，两种检测方法的一致性为优（Kappa=0.763）。凝集菌团被证实为痢疾杆菌占82.9%。结论 免疫培养-凝集法具有操作简便、快速、特异性好和敏感性高的优点，在疫情调查处理和患者的早期诊断治疗中具有一定意义。 关键词：免疫培养-凝集法；细菌培养；痢疾杆菌
细菌性痢疾是常见多发传染病，快速检出病原菌对控制疫情和早期诊断治疗患者具有十分重要意义。本文采用免疫培养-凝集法，在实验室研究的基础上，检测111份菌痢患者和非菌痢患者粪便样品，现将方法和结果报告如下：
1 实验材料
1.1 菌种 F1a、F2a、F3a、F4a、F5、F6型福氏痢疾杆菌和宋内型痢疾杆菌，来自湖南省疾病预防控制中心和慈利县疾病预防控制中心检验室保存的菌株。
1.2 抗痢疾杆菌免疫血清的制备：按文献[1]用家兔分别制得F1a、F2a、F3a、F4a、F5、F6型和宋内氏七个型的免疫血清。试管凝集效价F1-F6均为1：3200，宋内氏为1：6400。用4株大肠杆菌（正常人粪便中分离出）的混合菌液（>30亿/ml）吸收2次，除去非特异性抗体，吸收后特异抗体效价为1：1200，实验时用稀释度为1：20。
1.3 GN增菌肉汤培养液、甘油缓冲盐水保菌液和SS培养基按常规法配制。
1.4 粪便标本：来自慈利县疾病预防控制中心、慈利县中医院门诊和住院患者，取粪便约1g，保存在甘油缓冲盐水保菌液中。
2 实验方法
2.1 粪便标本处理 已加入粪便的甘油缓冲盐水保菌液，混合后1000rpm离心10min，上清液作检验样品。
2.2 被吸收后的抗血清用GN增菌肉汤1：20稀释，取2滴加于载玻片两端的凹窝，取被检样品上清液1接种环于左侧混匀，再从中取一环于右侧混匀，置塘瓷温盒中37℃培养4～6h后，取出肉眼观察结果，有1个以上灰白色絮状圆形凝集菌团为阳性，无凝集菌团为阴性。
2.3 患者粪便样品同时以常规细菌培养法作平行试验，以F2a和宋内氏菌株作阳性对照，并设阴性对照。
2.4 用微量注射器吸取凝集菌团，放入SS平皿中，用接种环划线，37℃培养18～24h后，按常规法分离鉴定。
3 结果
3.1 免疫培养-凝集法和细菌培养法同时检测111份菌痢患者和腹泻患者粪便样品，免疫培养-凝集法的检出率为36.9%，与常规细菌培养法的检出率33.3%没有差别（P=0.388），见表1。
3.2 两种检测方法一致的检出率为29.7%，以细菌培养法阳性样本为参考，两种检测方法检出符合率达89.2%。两种检测方法一致性为优（Kappa=0.763， P<0.001），见表1。
3.3 对41份免疫培养-凝集法阳性样品的凝集菌团进行纯培养鉴定，有34份被证实为痢疾杆菌占82.9%，其菌型与细菌培养一致，结果表明免疫培养-凝集法的检出结果是可靠的。
4 讨论
免疫培养-凝集法是将传统的细菌增菌培养与抗血清的凝集反应进行有机的结合，使痢疾杆菌在含有相应抗血清的液体培养基中生长的同时又不断的与相应抗体结合，进而成凝集性生长繁殖，可形成直径在100μm左右的灰白色特异性凝集菌团[2]，从而使该方法具有操作简便、快速、特异性好、敏感性高的优点。
有4份常规细菌培养法阳性的样品，而免疫培养-凝集法则为阴性。这表明该方法存在病例诊断时的漏诊现象。造成的原因，一是这4份样品中有1份细菌培养法检出为痢疾志贺氏菌，不属免疫培养-凝集法使用的混合特异性抗血清检测范围所致。二是另有2份样品常规细菌培养法检出为未定型株，说明痢疾杆菌的抗原性变异亦是该方法漏诊的原因之一[3]。
该方法使用的抗血清需经肠道菌吸附，以除去其它肠道菌的非特异性抗原[1]，另外GN增菌肉汤培养液，既有增菌培养作用，又有抑制粪便中其它肠道菌生长的使用[4]，以及接种时取经离心沉淀处理的上清液粪便样品，这些都是减少非特异反应的措施。
免疫培养-凝集法与细菌培养法具有很好的检出一致性，检出阳性时间只需4～6h，克服了常规细菌培养法时间长的缺点，对疫情的处理和患者的诊断治疗都有重要意义。
参考文献：
[1] 上海市卫生防疫站.卫生防疫检验：细菌检验[M].上海科学技术出版社，1979，23-35.
[2] 鲁开国，陶秀莲，生菊，等.免疫微菌落染色法快速诊断霍乱弧菌研究[J].中国卫生检验杂志，1994，4：202-204.
[3] 张卓然，倪语星.临床微生物学和微生物检验[M].3版，北京：人民卫生出版社，2003：119.
[4] 胡小玲，沈永芳.沙门-志贺菌增菌培养基的研究[J].实用预防医学，2006，13（4）：1025-1026.编辑/王海静
http://m.zhuodaoren.com/tuijian325778/
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