注射间充质干细胞密度大，不利于皮肤创口的愈合(一)
β射线照射皮肤损伤创面注射骨髓间充质干细胞后的创面愈合
【注射间充质干细胞密度大，不利于皮肤创口的愈合】
DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.06.001
骨髓干细胞
β射线照射皮肤损伤创面注射骨髓间充质干细胞后的创面愈合
研究亮点:
通过CD31、CK4、成纤维细胞生长因子免疫组织化学的对比分析，骨髓间充质干细胞悬液皮下及真皮层注射治疗组大鼠创面中毛细血管内皮细胞、表皮细胞、成纤维细胞明显多于注射安慰剂的对照组(P < 0.05)。作者推测具有分化潜能的骨髓间充质干细胞可在皮肤微环境诱导下直接分化为表皮细胞和血管内皮细胞，并分泌成纤维细胞生长因子促进创面愈合。
注射间充质干细胞密度大，不利于皮肤创口的愈合(二)
间充质干细胞
间充质干细胞通过大动脉内皮细胞时表现稳定的粘合性，表面分布不均、分散性及跨迁移的特征即；趋化因子与切力效应
作者：Giselle Chamberlain, Helen Smith, G. Ed Rainger, Jim Middleton 摘要
间充质干细胞具有抗炎症，抑制免疫力的性质，或许在如动脉硬化这样的疾病治疗中发挥作用。间充质干细胞能够进入炎症细胞，然而为了在临床上运用，人们需要阐明他们迁移机制。本研究探究了鼠类间充质干细胞与其迁移到小鼠动脉内皮细胞的相互关系，以及趋化因子，剪切压力的效应。通过生理流动条件实验研究鼠类间充质干细胞与MAEC的相互作用，鼠类间充质干细胞在连续流动条件下没有表现出相互作用。然而，当流动停止十分钟，再开始，鼠类间充质干细胞慢慢的附着在内皮细胞表面，延展成良好的微绒毛过程（丝足）。然后他们以不同方向散布在伸展的丝足。CXCL9显著提高了鼠类间充质干细胞的附着、表面非均匀分散及扩散的比例，剪切压力明显刺激了后两者。间充质干细胞通过鼠类动脉内皮细胞过程中，CXCL9, CXCL16, CCL20 和 CCL25 明显增强了跨内皮迁移。小鼠间充质干细胞的跨迁移抑制受体CXCR3，CXCR6, CCR6 和 CCR9. 本研究促进了对间充质干细胞内皮跨迁移，趋化因子、剪切压力的效应的了解，这与如动脉硬化的炎症息息相关。
介绍
间充质干细胞分化成许多不同的细胞谱系的能力，如同他们抗炎及免疫方面的特征，都没有伦理上的争议；培养相对容易使得间充质干细胞在许多炎症与损伤的治疗中成为一种理想的干细胞来源[1]。间充质干细胞能够在动脉硬化的抗炎治疗中发挥作用，有报道用培养的间充质干细胞治疗心肌梗塞[2–4]；同样，在像中风，脊椎损伤[5,6]、脑脊髓炎 [7]、辐射损伤[8]、皮肤损伤[9]和移植物抗宿主疾病情况[10]，间充质干细胞发挥潜在作用。虽然在治疗像非愈合骨折这样的特点疾病下[11]，间充质干细胞定向移动发挥作用，但是它也与间充质干细胞周身侵泡配合问题有关，如钙化与组织损伤[12]。周身移动带动多向移动，而且可能比定向传递更少发生侵略性的过程。为了通过周身递送直接治疗动脉硬化，间充质干细胞需要横穿动脉内皮进入组织发挥抗炎效应，然而通过这样途径间充质干细胞迁移、移植并不非常有效[13]，还需要了解间充质干细胞从血液到组织是怎样迁移的，以至于这样的补充过程能够减少炎症的发生与增强组织修复。
我们已经非常了解多层附着的白血球及这些细胞是如何从循环中迁移到炎症组织中的[14,15]。白血球在细胞内皮表面进行一系列相互作用，如结合，旋转，激活，捕捉，传递，蠕动，接着进行跨内皮迁移。然而，我们不知道间充质干细胞是否与内皮细胞发生相似的作用，也不知道哪些因子调控跨内皮迁移。除此之外，间充质干细胞与内皮细胞相互作用在循环中产生生理作用即流体剪切压力需要得以解决，因为这队白血球非常重要[16].
趋化因子受体与配体是重要的组分涉及在白血球细胞移动到炎症位点，最近我们阐明了在标准Boyden-type 小室中，用去掉内皮细胞后，鼠类间充质干细胞上不同趋化因子受体的功能表达。我们和其他人报道了[17–22]在人类间充质干细胞中趋化因子受体表达，其中与一些鼠类相同（如CXCR3,CXCR6 和CCR9因子）。我们了解有许多白血球附着分子参与细胞横穿内皮组织的迁移过程，有报道其中一些在间充质干细胞上表达
[23,24]。对间充质干细胞附着内皮组织产生重要功能的附着分子对群有CD44, VCAM-1及其相反配基VLA-4和其他b1结合蛋白[25–28]。然而，人们很少了解间充质干细胞内皮反向迁移的机制与趋化因子在驱动这种机制上的作用。最近有两个研究实验探究了在体外静态条件，通过内皮细胞与间充质干细胞的共培养下跨内皮迁移过程[27,29]。他们都发现当内皮细胞被炎症细胞因子刺激，间充质干细胞表现了形态学的变化及与内皮单层细胞结合。他们也发现间充质干细通过原生质突起进入内皮细胞，分泌MMP-2（基质金属蛋白酶）,它是一种促进造血干细胞运输的基底膜上退化膜酶 [30]。
现在研究的目标致力于研究鼠类间充质干细胞附着于鼠类大动脉内皮细胞的趋化因子效应与剪切力效应。第一次发现与内皮细胞接触时间充质干细胞扩散蠕动，并在趋化因子刺激与剪切力作用下，得以增强。趋化因子也促进鼠类间充质干细胞横穿大动脉内皮细胞的跨内皮迁移，这将下调被迁移的趋化因子受体细胞。我们先前提到了小鼠间充质干细胞表达存在于人间充质干细胞一些相同的趋化因子受体。[17],因此进一步研究选择性趋化因子受体的作用，这些小鼠间充质干细胞可成为在动脉硬化与心肌梗塞体内模型中一种有用的模型。
方法:
分离与扩培养小鼠间充质干细胞
小鼠间充质干细胞从6-10周大小的小鼠获得，按照相关文献方法分离[17,31] ,这种符合伦理学方法来自英国欧斯威特的RJAH医院。简单来说，骨髓来自长骨中，细胞来自细胞分离培养基(RPMI-1640 (英国龙沙公司) ，培养基中含有9%FBS，9%血清（两者皆来自英国杰生公司）并在37℃，5% CO2.。在24小时后没有附着的细胞被去除，四周后，细胞在含有9%FBS，9%马血清的完全扩大培养基(CEM) (Iscove Modified Dulbecco Medium(Lonza)以每平方厘米一百细胞涂布来扩增间充质干细胞。这些细胞对CD105具有95%的活性，而对CD45和CD34完全失效[17].当在成骨或脂质培养基生长时，分别对碱性磷酸酶与胞内脂质产生活性[17]。
小鼠内皮细胞的培养
小鼠动脉内皮细胞株来自日本鹤见牙医大学Hiroko Inoue博士的馈赠。此细胞株以缺失p53的小鼠动脉上获得的[32]。细胞株拥有内皮细胞的表型，微贝尔-帕拉德小体 ，内皮组织标记和粘合分子。此外，TNFa促进淋巴细胞附着在小鼠动脉内皮组织上，以此提供了在体外研究炎症与白细胞迁移的模型。在199培养基 (英国sigama公司) 37℃，5% CO2培养生长细胞，培养基中含有5%FBS，1U/ml肝素纳和5ng/ml小鼠VEGF （派普泰克公司）。培养基每3-4天更换一次。
从LGC公司 的Promochem (ATCC)(英国物理研究所) 购买了脑内皮细胞株，并起先从BALB/c系小鼠脑部内皮瘤分离得到[33,34]。通过观察凝血因子的表达与摄取的荧光标记的低密度脂肪确定该细胞的内皮性质。内皮细胞表达的其他分子也通过像CAM-1 and VCAM-1这样的细胞稳定表达，或者受到肿瘤坏死因子或脂多糖刺激而减少。比如E-选择蛋白与P-选择蛋白生长在添加有抗体与10%FBS的 DMEM 培养基上(Lonza)
流动估测
小鼠动脉内皮细胞接种在Ibidi 载玻片 (Wolf laboratories,Pocklington, UK)，生长聚
集，在37℃，用100 ng/ml 的小鼠TNF因子刺激16个小时。然后用基质清洗；用100 ng/ml小鼠CXCL9(MIG) 处理30分钟(Peprotech)（此步骤选作）。在37℃注射器泵以一定的速率吸取载玻片液体以进行流量分析，同时通过相对的显微镜观察可以见到载玻片中细胞
[35]。
在没有血清的培养基上小鼠间充质干细胞以 (1*106/ml) ，0.1Pa，4分钟灌注微管中，然后用基质以同样的流速清洗15分钟。记录影像过程分析间充质干细胞的行为。小鼠间充质干细胞也以4*106/ml添加到微管中，然后无血清的培养基以0.1pa进行2小时的灌注。自始至终每15秒拍摄照片来检查间充质干细胞与内皮组织的相互作用。
跨内皮趋化性试验
具有8mm孔径滤膜器涂有来自Sigma公司的人类质粒的纤练蛋白 (4 ug/ml in PBS) ，转移至24槽平板用sigmacote处理，以避免附着迁移的细胞。将近4*105 小鼠动脉内皮细胞将接种在每一个半透膜过滤网上，以100%聚集两天，再用无血清基质上的小鼠TNFa因子在37℃培养4小时来激活该细胞。留下三个没有刺激的样作为对照。用含有8 mm Calcein-AM (Molecular Probes, Invitrogen)的pBS在37℃培养30分钟可获得小鼠间充质干细胞。同时，含有（或无）小鼠CXCL9 (MIG), CCL20 (MIP3a), CCL25 (TECK) 和 CXCL16 (Peprotech)培养基以不同的比例添加到具有24孔的平板上的滤膜器，每种条件做三次重复。
600,000 小鼠间充质干细胞添加到每一个滤膜器的上层37℃在无血清培养基悬浮，平板放置在37℃，5% CO2 和 90% 湿度过夜16小时培养。已经迁移至底层的小鼠间充质干细胞的数目用FLX800微板荧光阅读器 (Bio-tek Instruments Ltd, Potton, UK)（本设备已建立荧光与细胞数比例的标准曲线）来计算。
所使用的每一个趋化因子数目是10 ng/ml。这是基于先前所作的实验(0–1000 ng/ml) 即在Boyden-type趋化性评估中使用同样小鼠间充质干细胞[17]。结果显示特别能刺激间充质干细胞迁移的最有效浓度是10 ng/ml 或100 ng/ml；低于10 ng/ml或高于500 ng/ml的趋化因子不能刺激迁移[17]。因此，在目前跨内皮迁移实验中使用10ng/ml和100ng/ml的趋化因子，发现前者浓度对刺激间充质干细胞效果明显而后者产生重要结果。
液式细胞计检查
来自跨内皮趋药实验或从含有胰蛋白酶与EDTA的烧瓶中分离得到的间充质干细胞在4℃在PBS与2%BSA的缓冲液中重悬60分钟。缓冲液中含有10%的血清来阻止非特异结合。通过台盼蓝鉴定到细胞具有超过95%的活性。用饱和合适的含有第一抗体的缓冲液的间充质干细胞在冰上放置30分钟培养，清洗。再用合适的第二抗体进行染色。放置冰上30分钟后清洗；最后用链霉亲和素与聚乙烯共轭标记染色30分钟[17]。【注射间充质干细胞密度大，不利于皮肤创口的愈合】
作为阴性对照，细胞也可用相同类型免疫球蛋白替代先前的抗体进行染色，同上文所述第二抗体与链霉亲和素相同。抗体有抗鼠CCR6,CCR9，CXCR3，CXCR6因子，小鼠IgG2a和IgG2b 阴性对照，(英国阿宾顿的安迪生物公司) ；生物素化的抗鼠免疫球蛋白和链霉亲和素与聚乙烯共轭物（来自英国牛津的BD Pharmingen公司）。在跨内皮趋化因子实验中，间充质干细胞对每个趋化因子受体活性百分比由在 FITC/FL1 通路中钙黄绿素标记细胞所决定，这种控制也用于在免疫球蛋白对照后平均荧光强度。【注射间充质干细胞密度大，不利于皮肤创口的愈合】
统计
为了了解小鼠间充质干细胞在在趋化因子存在下跨内皮迁移在机制，我们使用方差分析，方差分析用一系列合适数据对比，用Dunnett测评来作为对照。在通过影像数据分析小鼠间充质干细胞附着百分比时，蠕动，扩散，非配对T测试用来与趋化因子处理对照进行比较。
结果
在剪切流条件下，小鼠间充质干细胞与活化TNFa的内皮组织间的相互关系。载玻片上接种小鼠动脉内皮细胞，用100 ng/mlTNFa刺激。
间充质干细胞以 0.1 Pa流过载玻片，这是一个生理流动速率过程，如同白血球在毛细血管后微静脉中的流动或在动脉循环中低剪切环境（这种环境下易产生动脉硬化）。观察间充质干细胞与内皮组织的任何相互作用。小鼠间充质干细胞流过载玻片四分钟后，没有出现间充质干细胞与内皮组织的相互作用。在用TNFa（或没有TNFa)处理细胞后，没有观察到间充质干细胞继续迁移或附着在内皮层。我们将重复这个实验，用活化的TNFa（或没有TNFa）的小鼠动脉内皮细胞添加100 ng/mlCXCL9, CXCL16, CCL20 a和CCL25趋化因子处理30分钟（或不添加任何细胞因子）；选择这些趋化因子是因为他们是先前在小鼠间充质干细胞上所示的趋化因子的配体[17]。这一次，在用上述处理后(影片 S1)，也没有见到小鼠间充质干细胞与内皮组织的作用。这个过程的流速也减慢到起速度的一半以下，例如 0.15 ml/min (0.05 Pa, 0.5 dynes/cm2)，但是小鼠间充质干细胞没有继续前进或附着在内皮组织上，不管有没有趋化因子的存在。同样，在流动情况下，用小鼠脑内皮细胞，bEnd.3 细胞替代小鼠动脉内皮细胞，也没有间充质干细胞在上述细胞上的移动与附着。
下一间充质干细胞将添加到小鼠动脉内皮细胞上（单独用100ng/mlTNFa刺激16h或用存在CXCL9趋化因子，100 ng/ml TNFa 处理30分钟。在静止的情况下10分钟后留下这些细胞，然后流量以 0.1 Pa (1 dyne/cm2）启动进行2小时。间充质干细胞显现为圆形，逐渐将阐明内皮细胞的背景(图一）。当流动开始，残留有76%的间充质干细胞紧密的附着在用单独TNFa处理的内皮细胞上，然而用CXCL9和TFNa处理的内皮细胞有94%的间充质干细胞附着于上，这一个结果比存在趋化因子差异显著（P=0.04）（图二）；间充质干细胞其余部分已分离或流走。在接下来超过两小时的流动中，70%的间充质干细胞附着在用TFNa处理的内皮细胞上，并蠕动；然而有94%的间充质干细胞在存在CXCL9 和 TNFa的内皮细胞上附着蠕动，总结果相对于趋化因子有明显的增加(p = 0.02) (图 2)。蠕动是间充质干细胞的特点，呈现持续明亮，圆形，在内皮细胞上表面横向运动，伸展成良好的微绒毛形成过程（或伪足）(图 1; 视频S2 and S3).这些丝状伪足迅速移动并与间充质干细胞连接，像千足虫的爬行。定量分析显示在蔓延之前，小鼠间充质干细胞在分别用TNFa或CXCL9/TNFa 处理下，蠕动距离分别为 23+6 mm 和 21+2 mm （平均值+在每种情况下三个独立实验的标准差），在这个测试值之间没有显著差异。在单独存在TNFa时，37+7%的间充质干细胞蠕动方向与流动方向相反，在用CXCL9/TNF处理下，有65+9%的相反，36+9% 的同流动方向相同（数据是平均值+在每种情况下三个独立实验的标准差）。就TNF 和CXCL9/TNF两种处理和蠕动方向，这些测量值没有明显差异。
胞上的蠕动。
小鼠动脉内皮细胞经TNFa处理，添加小鼠间充质干细胞，放置10分钟。然后开始流式处理，持续2小时，视视频记录。流动的方向用白色大箭头显示。A,显示的是在开始有剪切压力后，有TNFa刺激的小鼠动脉内皮细胞的一张低分辨率图，其上有处于附着阶段的明亮间充质干细胞(见视频2）。B—F位于A图右下方，显示的是间充质干细胞的具体情况。B是一开始进行剪切压力的状态，C,D,E,F分别是流动30分钟，60分钟，80分钟，120分钟的状态。用星号标注是作为参考来说明在这段时间后间充质干细胞的蠕动，在120分钟后（F)细胞停止蠕动，开始蔓延，进入隐蔽期。在间充质干细胞周围边缘可作为隐蔽期微绒毛形成（伪足）（箭头处），即在内皮细胞表面间充质干细胞蠕动期间延展。从视频2中提取数据，代表3个独立实验。白线在A图表示100mm.在B—F 图表示20mm.
图2，在小鼠动脉内皮细胞附着与蠕动的小鼠间充质干细胞百分比
有TNFa激活的小鼠动脉内皮细胞用CXCL9培养（或无CXCL9),然后添加小鼠间充质干细胞放置10分钟，接下来对小鼠动脉内皮细胞进行2小时的录像。影像如图一所示。小鼠间充质干细胞进行相同处理，除了在两小时期间停止流动（带状）。数据为三个独立实验的平均值（+标准差）（文章编号7-9），与趋化因子对照相比，p<0.05。相对在流式条件下相同处理下，p<0.001 。
注射间充质干细胞密度大，不利于皮肤创口的愈合(三)
骨髓间充质干细胞的研究进展
[摘要] 骨髓间充质干细胞（BMSCs）是骨髓基质中存在的非造血系的成体干细胞，具有多向分化潜能，已成为国内外基础医学和临床医学研究的热点。本文简要介绍了BMSCs的概念提出、生物学特性、培养、鉴定，并根据近年来国内外包括应用中药进行的诱导分化、组织工程、基因治疗、再生医学等相关研究及临床应用前景作一综述。 [关键词] 骨髓间充质干细胞；诱导分化；组织工程；中药
[中图分类号] R392.12 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2013）08（c）-0025-03
早在1867年，世界著名病理学家Cohneim发现了骨髓中非造血系的干细胞，发现这类干细胞能够产生愈合伤口的成纤维细胞，后来Caplan[1]称之为间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs），因为这类细胞除骨髓外，还广泛分布于脂肪、外周血、脐血、羊水、胎盘、胎肺、胎肾、牙髓、肌腱、滑膜、骨骼肌等不同的组织中，可定向分化为造血细胞以外的神经胶质细胞、肌细胞、腱细胞、成软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞、平滑肌细胞等多种细胞，支持造血，对造血干细胞有扩增作用，具有贴壁生长、高度可塑、免疫调节的性质，在体外易分离和扩增，还易于外源基因的转入和表达[1-2]。本文在此基础上对骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）的研究及其应用作一综述，以期开拓新的研究领域和临床应用。
1 改良性的BMSCs分离培养和鉴定方面的研究
体外培养的小鼠及人的BMSCs形态学特征主要表现为梭形、纺锤形，少数为多角形。BMSCs的体外分离方法有四类：贴壁培养法、密度梯度离心法、流式细胞术和免疫磁珠分离法。贴壁培养法更换培养液去除造血系细胞后还残留有单核细胞、淋巴细胞贴壁生长，需要严格控制胰蛋白酶的剂量和消化时间，连续培养才能清除并得到相对的纯化[3]。其余方法虽然可以获得纯度较高的BMSCs，但易破坏其活性。因此培养鉴定方法的改良引起了研究者的兴趣，以期探索获得高纯度BMSCs的简单、系统的实验方法。
目前尚未发现公认的BMSCs特异性表面抗原。BMSCs表达CD34、CD106、CD124、CD105、CD146、CD90、CD13、CD44、CD54、CD29、CD73、CD120a、CD166等，不表达造血细胞的标志CD10、CD11b、CD14、CD31、CD34、CD45、CD49、CD106[4-6]，其中有关CD34、CD106的报道不一致。通常还是通过形态和培养特性结合免疫方法进行BMSCs鉴定。
2 BMSCs免疫研究
BMSCs抑制T细胞增殖导致免疫耐受[7]。把BMSCs与T细胞共同培养，T细胞不增殖，且可以对其他异物进行反应，随着干细胞的分化，其抗原性并未随之增加，说明BMSCs移植潜力很大。Miyake等[3]认为BMSCs能够体外抑制T细胞功能，指出BMSCs可以作为免疫调节剂，控制移植物抗宿主病的发生，以BMSCs注射受体小鼠骨髓腔，再注射供体细胞，能够预防移植物抗宿主病。
3 诱导分化与相应的组织修复研究
干细胞在不同的情况下表现出不同的分化方向。BMSCs经诱导后可定向分化为树突状细胞、多巴胺能神经元、关节盘细胞、心肌细胞、成软骨细胞、肌腱细胞、脂肪细胞、成骨细胞、星形胶质细胞、血管内皮细胞[7-10]，因而可望进行相应的组织修复，比如免疫功能的修复、分泌多巴胺的神经细胞的数量增加、关节盘的修复、损伤的心肌的修复、骨骼肌的修复、软骨和骨骼的修复、血管的修复等。BMSCs的体外分化是组织工程的良好方法。
4 BMSCs标记的改良研究
采用BrdU标记BMSCs，联合BrdU单克隆抗体进行免疫组化染色，48 h后细胞标记率>90%，且不影响细胞的形态、生长、增殖及分化。Zhang等[11]认为BrdU标记是对移植的BMSCs迁移、增值、分化等行为进行动态观察的切实可行的方法，而且具有无放射性污染、节约时间、操作方便迅速、标记效率高、准确性高等优点。
5 不同方向的动物实验及临床应用研究
BMSCs可被定向诱导分化为临床所需的多种组织细胞，因其取材方便、易于体外培养、扩增迅速、较弱的免疫原性，能较好地抑制混合淋巴细胞反应，不存在组织配型和免疫排斥等方面的问题，符合伦理道德原则，被称为组织工程及再生医学中理想的种子细胞[2，4]，可用于不同方向或目的的动物实验及临床应用研究。Zuo等[12]将关节软骨细胞与BMSCs共同培养，发现它们之间存在着相互作用，BMSCs对加强关节软骨基质的形成起着刺激和支持作用，直接接触的效果比可溶性因子的作用更大。Boonyagul等[13]应用不同浓度的乙酰化甘露聚糖处理大鼠BMSCs的体外实验结果显示，乙酰化甘露聚糖显著增加BMSCs的增殖，血管内皮生长因子、骨形态发生蛋白-2、骨涎蛋白和骨桥蛋白的表达，碱性磷酸酶的活性与骨质沉积。在体实验结果显示，乙酰化甘露聚糖治疗组与未处理的对照组相比有较高的骨密度，骨愈合快，治疗组骨小梁大量生长，表明乙酰化甘露聚糖可通过刺激BMSCs进行增殖，诱导骨形成的生物活性分子，使BMSCs分化为成骨细胞，合成细胞外基质。Xin等[14]将BMSCs与无细胞生物材料支架结合成功地重建了组织工程心脏瓣膜，表明种子细胞与生物支架整合的可行性，且促进血液中BMSCs的增值和分化。Matsumoto等[15]应用电刺激诱导BMSCs分化成神经细胞，然后移植给脑损伤模型小鼠，发现电刺激的BMSCs细胞顺利分化成神经细胞，而不是分化成星形胶质细胞，促进了脑损伤的恢复，且发现电刺激的BMSCs细胞表达神经元素2增加，通过β-catenin通路抑制BMSCs向星形胶质细胞的分化，促进其向神经细胞的分化，表明BMSCs治疗脑损伤的前景广阔。 6 中医药结合BMSCs的研究
中药可以通过调节微环境的生长因子水平，促进微循环血供，形成一个有利于移植细胞存活的微环境，促进干细胞的定向分化，进而应用于临床治疗。高志超等[16]应用补骨脂素诱导BMSCs，结果表明，BMSCs复合载异补骨脂素支架材料具有显著的骨诱导作用，可应用于临床修复骨缺损。范东艳等[17]将红景天苷与BMSCs联合应用治疗帕金森病大鼠，发现治疗后大鼠行为异常程度较轻，脑组织内酪氨酸羟化酶mRNA表达水平较高，表明联合用药优于单独应用中药或BMSCs。程小丽等[18]应用补肾益髓中药血清孵育BMSCs进行移植，显著提高了缺血脑组织中生长因子和神经营养因子的水平，较快地恢复了大脑功能；该研究团队还应用地黄饮子孵育BMSCs进行移植，能够显著提高大鼠缺血损伤脑组织的Bcl-2水平，降低Bax的水平，对缺血性脑损伤具有保护作用。
7 结语
BMSCs方面的研究进展很快，前进中也遇到了如下一些问题：①到目前为止，人们对BMSCs的认识仍停留在培养细胞的特征上，BMSCs的定义仍然是根据体外培养的细胞自我更新和分化的潜能而提出的“权宜性”的概念；人们对活体内干细胞的形态特征、发育起源、解剖定位以及在器官生成和出生后组织稳态中所起的作用还知之甚少；目前尚缺乏作为干细胞所应具有的非对称分裂特征的证据，未发现BMSCs特异性的表面标志物，难以直接鉴定，还是根据形态等非特异性表面标志物来判断，BMSCs的“干细胞性”还需要大量的实验来进一步证明。②由于干细胞的特性、分离方法的限制及BMSCs培养过程中的异质性，几乎不可能得到绝对纯化的BMSCs，分离方法的改良研究很多，仍需进一步深化。③由于实验方法、实验条件的不同，来自不同实验室的报道不尽一致，甚至有不少矛盾的地方，BMSCs在不同条件下可以治疗肿瘤，也可以导致肿瘤的发生和发展，还需要大量研究来界定条件，排除矛盾。尽管对BMSCs的特性还缺乏认识，从研究到应用还有个过程，考虑到从1970年起，人们对BMSCs的研究才40余年就取得了丰硕的成果，形成了如下共识，BMSCs具有多向分化潜能和易于体外扩增，取材容易，易于基因操作，组织相容性好，是组织工程、基因工程、组织再生修复的理想种子细胞，可望广泛用于脑缺血、心肌缺血等导致的组织损伤的修复、骨和软骨组织的修复、1型糖尿病患者胰岛细胞的分化、血液病和肿瘤疾病的治疗、基因治疗，中医药的引入拓宽了BMSCs研究的新领域，临床应用前景广阔。
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（收稿日期：2013-01-24 本文编辑：郭静娟）
注射间充质干细胞密度大，不利于皮肤创口的愈合(四)
TNF―α预处理脐血间充质干细胞移植心肌梗死大鼠心功能影响
[摘 要] 目的：研究肿瘤坏死因子（TNF-α）预处理的脐血间充质干细胞（HUMSC）血管细胞黏附分子-1的表达及其对心肌梗死大鼠心功能的影响。方法：实验组取第3代HUMSC用TNF-α（10 ng/mL）预处理24 h后，迁移黏附实验检测其体外迁移黏附能力，Western blot检测VCAM-1蛋白表达；对照组不用TNF-α处理。动物实验分为实验组（注射TNF-α预处理HUMSC）和对照组（注射HUMSC），取第3代HUMSC移植于心肌梗死大鼠的心肌内3周后，二维超声心动图检测大鼠左心室心功能。结果：与对照组比较，实验组体外迁移黏附力明显增强（P<0.05）；黏附分子VCAM-1的蛋白表达水平显著升高（P<0.05）；左心室射血分数明显提高（P<0.05）。结论：移植TNF-α预处理的HUMSC更能明显改善大鼠心功能，其机制可能与TNF-α提高HUMSC黏附分子VCAM-1的蛋白表达水平相关。 [关键词] 肿瘤坏死因子-α；脐血间充质干细胞；黏附分子
中图分类号： R332 文献标识码： A 文章编号：2095-5200（2015）04-004-05
每年全球约有1700万人死于心血管病，其中占总数1/2患者死于急性心肌梗死（AMI）[1]。过去30年中，MI病死率（30 d内）虽然已降至10% ，但年病死率仍为20% 左右[2]。目前，MI治疗方法以药物、介入和外科手术为主，这些方法可解除血管阻塞，缓解心室重构，延缓和改善心功能恶化及心律失常发生，但无法逆转坏死心肌，使已梗死心肌细胞再生。而干细胞治疗给人们带来了新希望。
MSC具有多向分化潜能、支持和促进造血干细胞植入、调节免疫以及分离、培养时操作简便等特点[3]。脐血间充质干细胞（Human Umbilical cord blood mesenchymal stem cells，HUMSC）是从脐带组织中分离出来，较祖细胞更原始，有更强增殖分化能力[4]；免疫原性较为幼稚，不易触发免疫反应或引起移植物抗宿主病；较骨髓MSC有更大应用潜能。
循环血液中干细胞归巢到缺血组织中是组织修复第一步，干细胞归巢第一步就是黏附于心脏微血管内皮细胞[5]，因此提高移植干细胞向受损组织迁移及定植对提高干细胞治疗效果具有重要价值。黏附分子广泛存在于细胞表面及细胞外基质中，通过与受体结合，介导细胞与细胞或细胞与细胞外基质接触，并参与细胞活化与迁移[6]。在炎症、缺血性损伤及伤口愈合等过程中发挥重要作用。生理状态下充质干细胞少量表达血管细胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1），而明显表达细胞间黏附分子（intercellular adhesion molecule-1，ICAM）[7]。Segers等[8] 研究发现，VCAM-1对BMMSCs黏附于心肌微血管内皮细胞具有重要作用，在加入VCAM-1抗体后可完全消除由肿瘤坏死因子 （tumor necrosisfactor，TNF-α）预处理增强MSC对内皮细胞黏附性，而加入ICAM-1抗体则MSC对内皮细胞黏附能力却没有明显变化。所以本研究用采用TNF-α预处理HUMSC，通过迁移黏附能力、VCAM-1表达和左心室功能变化等检测指标，探讨其对心肌梗死大鼠治疗作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物
雄性SD大鼠20只，清洁级，220～250 g用于心肌梗死造模，购自河南省实验动物中心，实验中对动物处置符合动物伦理学要求。
1.2 主要试剂和仪器
L-DMEM、胎牛血清（fetalbovine serum，FBS）购自美国Hyclone公司；0.25%胰酶、SDS-PAGE凝胶试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；TNF-α购自美国Peprotech公司；PVDF膜购自美国Sigma公司；VCAM-1一抗购自美国Bioworld公司；β-actin、二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司；倒置显微镜Olympus BX41购自日本Olympus公司；二维多普勒超声仪购自美国Phillips公司。
1.3 脐血间充质干细胞分离和培养
脐血来自于郑州市妇幼保健医院产妇志愿捐献足月妊娠顺产婴儿，参照文献[9]采用密度梯度离心法获取HUMSC，将分离细胞以5×106/mL接种于含体积分数为20%胎牛血清DMEM/F12培养液中培养。取第3代细胞用于后续实验。
1.4 细胞鉴定
将第3代HUMSC调整为1×106 /L 细胞悬液，用流式细胞仪进行细胞表面标志测定。细胞分别与鼠抗人FITC-CD90、PE-CD86、FlTC-CD45，PE-CD19、FITC-CD105、PE-HLA-DR、FITC-HLA-ABC和PE-CD34抗体反应，在4℃暗室中放置30min。以鼠抗人PE/FITC-IgG1为平行对照。数据用Cell Quest软件处理。
1.5 体外迁移实验
将第3代HUMSC浓度调整为5×106/mL，取100 μL细胞悬液接种于8 μm孔径24孔transwell小室上层，下层加入500μL含2%FBSL-DMEM培养基，实验组下层培养液中加入TNF-α使得其终浓度为10 ng/mL，对照组加入等体积PBS，置于细胞培养箱中继续培养。24 h后取出小室，用荧光倒置显微镜下观察并随即选取6个视野拍照后计数迁移至膜下表面细胞数目。
1.6 体外黏附实验
将第3代HUMSC长至80%融合时，实验组加入TNF-α（10 ng/mL）处理，培养24 h后，调整细胞浓度为1×106/mL，取1 mL细胞悬液经1200 r/min离心3min后重悬于250μLL-DMED中，然后接种于胶原包被24孔板，静置15 min后，用PBS洗两遍，去除未贴壁干细胞。显微镜下随机选取6个视野拍照后计数。 1.7 Western blot检测黏附分子蛋白表达
实验组加入TNF-α（10 ng/mL）处理，培养24 h后，调整细胞浓度为1×106/mL，加入上样缓冲液后100℃水浴变性5 min，10SDS-PAGE电泳，转移至PVDF膜上。封闭液封闭2 h，加一抗孵育12h，HRP标记二抗孵育2 h。洗膜后将增强化学发光液（ECL）涂于PVDF膜上，曝光并采集图像。Ge1-Pro analyzer 4软件分析蛋白条带，以β-actin表达量作为参照。
1.8 大鼠心肌梗死模型制备和细胞移植
麻醉大鼠后，接心电监护、气管插管并接上小动物呼吸肌，于心前区肋间隙进入胸腔并刺破心包，在与左心耳交界处下方0.2cm处缝扎左前降支动脉，可见心电监护ST段显著抬高。术后关胸常规肌注30万U青霉素，心肌梗死模型复制成功后1周，大鼠随机分为对照组和实验组各10只。对照组大鼠梗死局部心肌内注射HUMSC100μL（1×105个），实验组大鼠梗死局部心肌内注射第3代TNF-α预处理HUMSC100μL（1×105个），所有动物随后关胸并给予抗生素处理。
1.9 超声心动图检测大鼠心功能
移植后3周，大鼠麻醉后固定于鼠板上，二维多普勒超声仪检测大鼠左心室舒张末内径（left ventricular end-diastolic dimension，LVEd）、左心室收缩末内径（left ventricular end- systolic dimension，LVDs），按照公式：LVEF=[（ LVDd）3-（ LVDs）3]/ （ LVDd）3×100%计算射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）。
1.10 统计学处理
采用GrahPad Prism 5.0统计软件进行分析，数据以x±s表示，两组间比较用t检验，a=0.05。
2 结果
2.1 脐血间充质干细胞分离培养
倒置显微镜下可见，培养初期胞体小且呈圆形（图1A），2d以后逐渐变为椭圆、胞体变大（图1B），7d（第3代）后向两级伸出凸起为长梭形（图1C）。
2.2 细胞检测结果
流式细胞仪检测结果显示CD34、CD45阳性率不足10%，提示大部分人脐带间充质干细胞不是造血干细胞。CD19和CD86阳性率少于10%，CD90、CD105阳性率高于70%，主要组织相容性复合体HLA-ABC阳性率为90% 以上，HLA-DR阳性率低于5%，结果提示人脐带间充质干细胞和间充质干细胞细胞表型相似。
2.3 体外迁移能力
结果表明与TNF-α共培养24h后，TNF-α处理组从小室表面迁移到小室下表面细胞数目（26.4±2.8）明显多于PBS组（6.9±1.7），差异有统计学意义（P<0.05）。说明TNF-α可以增强干细胞体外迁移能力。（见图2a/b）
2.4 体外黏附能力
结果表明与TNF-α共培养24h后，TNF-α处理组黏附于培养板细胞数目（41.2±3.6）明显高于PBS组（7.8±1.3），差异有统计学意义（P<0.05）。说明TNF-α可以显著增强干细胞黏附能力。（见图3a/b）
2.5 黏附分子VCAM-1表达
用Western blot法检测转移至膜上蛋白含量，结果表明，PBS组VCAM-1表达较低，TNF-α处理组能显著诱导VCAM-1蛋白合成，约为对照组3倍，两组间差异具有统计意义（见图4）。
2.6 TNF-α预处理HUMSC对大鼠心功能影响
移植后3周，对照组（HUMSC）有2只大鼠死亡，实验组（TNF-α预处理HUMSC）有1只大鼠死亡。LVDd、LVDs、LVEF结果见表1，多普勒超声心动图结果显示，实验组LVEF明显高于对照组（P<0.05）。说明经TNF-α预处理HUMSC移植可以明显改善心功能。
3 讨论
MSC具有较强扩增能力，可分化成心肌样细胞和有助于血管形成血管平滑肌细胞以及血管内皮细胞，能参与心肌缺血引起心肌重构和血管再生，达到替代损伤心肌细胞，改善心功能目[10]。由于MSC缺少主要组织相容性复合体II ，可参与免疫调控但具免疫豁免性，增强了异体细胞移植安全性，因此最有可能发展成标准化治疗，从而满足大部分人治疗需求[11]。很多研究者认为，干细胞可能是通过旁分泌而不是替代梗死心肌来发挥改善心功能作用[12-13]，目前已发现多种干细胞因子以旁分泌产生作用[14-15]。
脐血中含有丰富间充质干细胞[16]，是近年发现具有与骨髓干细胞细胞（BMMSC）相同多向分化潜能原始祖细胞，和其他来源干细胞相比，脐血来源广泛，脐血中淋巴细胞免疫功能不够成熟，免疫原性较弱，移植物抗宿主病发生率较低[17-18]；HUMSC易于分离[19-20]为一种新可靠干细胞来源，在适当条件下具有向神经细胞、成骨细胞、心肌细胞等组织细胞多项分化潜能[21]。
目前，已有多种干细胞应用于MI临床治疗研究[22-23]，但HUMSC移植治疗MI还比较少。干细胞移植治疗主要困难之一是移植干细胞只有很少一部分能存活和植入心肌中。所以如何提高干细胞移植存活率成为研究者首当其冲问题。Luo 等[24-25]研究发现在梗死区边缘区注入高表达血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）干细胞，可以减少梗死区面积，增加梗死区周围心肌血管生成，促进冠脉结扎实验中心脏功能恢复。Ries 等[26]研究发现提高BMMSC基质金属酶表达，可以促进细胞趋化和迁移。
心肌梗死后会释放大量炎症介质，这些介质一方面可以促进组织修复和增强心肌对缺血适应，但另一方面这些介质也可以促进心肌细胞凋亡和加快基质降解进而抑制和减低心功能[27-29]。以前研究重视干细胞移植后如何降低炎症因子表达，但新近有研究[30-32]证实用炎症因子处理过干细胞移植能明显改善心功能，促进心肌功能恢复。Herrmann等[33]研究发现，用TGF-a预处理24h BMMSC移植可以增加VEGF表达，进一步保护大鼠心肌和减少坏死区域面积。 本研究之所以选择TNF-α浓度为10 ng/mL是因为这一浓度刺激可以激活干细胞旁分泌而不改变其表面活性物质[34]。有研究[35]显示移植MSC可以促进梗死区炎性因子如TNF-α、白介素-6和转化生长因子等释放，这些因子又对细胞旁分泌起重要作用。因此研究移植后干细胞对炎性环境应答对提高其存活率和改善心功能有更重要价值。
参 考 文 献
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http://m.zhuodaoren.com/shenghuo326151/
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