神经的信号通路(一)
海马神经信号通路
突触后的调节作用
关于某些分子能作为逆向的
突触信号分子的猜想已经由来已久。例如NO分子，CO分子或arachidonic acid都被证明能从突触后神经元扩散至突触前神经元，但这些证据并不是没有疑问的。最近三篇文章提出，突触后释放cannabinoids能够抑制海马和小脑神经元的突触释放。
当一个海马神经元去极化时，对此细胞的抑制性输入会被暂时失活，这叫做DSI 'depolarization-induced suppression of
inhibition'。Wilson and Nicoll对海马切片中DSI的可能机制进行了研究，发现cannabinoids从突触后细胞的释放能抑制GABA介导的神经释放，而GABA正是抑制性输入之一。研究者发现尽管【神经的信号通路】
cannabinoids释放是钙离子依赖的，但并不与小泡融合有关，因为botulinum不能抑制DSI。
Ohno-Shosaku et al.研究了培养的海马神经元中的DSI，发现内源性的cannabinoids与突触抑制有关。它们还发现通常用于产生DSI的强烈去极化对产生抑制并非必需，一个突触后神经元的动作电位就足以诱导DSI。
这种突触抑制的形式仅在抑制性突触中观察到。Kreitzer and Regehr 发现在小脑中的兴奋性突触有类似的DSE(depolarization-induced suppression of exitation)存在。Purkinje细胞的去极化能抑制平行纤维和爬行纤维的输入，这个抑制作用依赖于内源性的cannabinoids 。而且他们观察到突触前钙离子的内流在DSE中被减弱，说明cannabinoids可能通过抑制突触前的钙离子通道来发挥作用。
DSI和DSE 都说明了内源性cannabinoids的第一个功能
The Wnt pathway (named as a hybrid of Wingless and Int ) regulates cell fate decisions during development of a vide variety of animal species. Secreted Wnt glycoproteins bind to the Frizzled receptor, a family of serpentine receptors, to activate Dishevelled, a PDZ domain protein. Dishevelled acts to inhibit a cytoplasmic complex involving GSK-3, axin and APC that acts to degrade beta- catenin. GSK-3 phosphorylates beta-catenin leading to ubiquitination and degradation by the proteosome. Activation of the Wnt pathway inhibits
degradation of beta-catenin allowing its nuclear transport and gene induction via binding to TCF. During the elaboration
of cell types and tissues, the Wnt pathway often interacts with the FGF and TGF-beta path【神经的信号通路】
其分子机制为: 在没有Wnt 信号时, 胞浆内的b- 连环蛋白大部分与细胞膜上的钙黏蛋白(Ecadherin)结合, 少部分与轴蛋白(axin)、腺瘤性结肠息肉病基因蛋白(adenomatous polyposis coli, APC)、酪蛋白激酶(casein kinase, CK)、糖原合酶激3b(GSK-3b)形成巨大复合物, CK1 对b- 连环蛋白的第45位残基进行丝氨酸/苏氨酸磷酸化, 此反应又催化了GSK-3b 对b- 连环蛋白的第41、37 和33 位残基磷酸化, 被磷酸化标记的b-连环蛋白被泛素连接酶b-TrCP蛋白识别进而被泛肽化, 最终导致b-连环蛋白通过蛋白酶体被降解, 因而胞浆内游离b-连环蛋 白水平极低。当有Wnt 信号传入时, Wnt 蛋白与七次跨膜受体卷曲蛋白(frizzelds, Fzd)的胞外区结合, 在辅助受体LRP5/6 协同作用下, 胞质中的散乱蛋白(dishevelled, Dvl)被募集至胞膜附近, Dvl能够促进GSK- 3b等物质磷酸化, 使其从轴蛋白上脱落, 打散了b-连环蛋白降解复合体, 使其不能被降解, 大量游离的b-连环蛋白在胞质中聚集, 这种累积打破了细胞内原有的b-连环蛋白出核和入核平衡, 使得细胞核内的b- 连环蛋白大大增加。转录因子Tcf/Lef-1能通过HMG 框结合在DNA 特定元件上。在没有与b-连环蛋白结合时, Tcf/Lef-1与许多转录抑制物结合形成复合物, 如转录抑制因子CtBPgroucho/TLE, 抑制靶基因的转录。当b-连环蛋白进入核内, b-连环蛋白与Tcf/Lef-1家族成员的氨基端结合, 降低了与转录抑制物的结合亲和力, 同时还招募了转录所需的辅助激活因子如CBP/p300
[1]、BCL9/LGS 和Pygo [2]等, 从而解除抑制作用, 促进Wnt靶基因的转录激活。
Dvl 是一种磷蛋白, 其丝氨酸和苏氨基酸残基易受Wnt信号激活而被磷酸化, 是组装轴蛋白复合物所必须的连结分子, 含有结合轴蛋白、CKIe、CKII、FRAT(frequently rearranged in
advanced T cell lymphomas)蛋白的结合部位及Dvl 间多聚位点, 具有募集轴蛋白、CKIe 等物质的作用, 并且这种向细胞膜趋化的作用在Wnt 信号传递以后还存在[12]。当Wnt信号途径激活时, Dvl 被上游信号激活,一端与Fzd的胞内部分相连, 另
神经的信号通路(二)
影响大脑皮质神经细胞生成的信号通路
DOI: 10.3969/j.issn.1673-5374.2013.01.003
Basic Research
影响大脑皮质神经细胞生成的信号通路
A Disintegrin and Metalloprotease 10 in neuronal maturation and gliogenesis during cortex development
神经的信号通路(三)
神经干细胞增殖信号通路网络分析
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神经干细胞增殖信号通路网络分析
作者：刘庆山 庄述娟 李克琴 李旭
来源：《中国中药杂志》2014年第03期
摘要： 脑内神经干细胞具有增殖和分化能力，对脑皮质功能重建非常关键，寻找调控脑内神经干细胞增殖的关键靶点和网络通路意义重大，也是医学界亟待解决的难题。该文以Notch通路作为网络核心，总结了国内外对Wnt，Shh，EGFR，细胞因子等信号与Notch信号通路构成的生物分子网络系统进展，重点分析了Notch通路中的Notch受体，CBF1，NICD，Hes1等关键节点，这些节点可能成为未来新型药物作用的潜在靶点。中药具有多成分、多靶点、多层次的特点，与网络药理学有共通之处。中药的有效成分组或活性成分群是其发挥网络药理学效应的物质基础之一，值得深入探索。该文旨在为中药治疗神经退行性病变和神经损伤提供新的策略。
关键词： 神经干细胞；增殖；Notch；Wnt；Shh；中药；网络药理学【神经的信号通路】
[收稿日期] 2013-06-30
[基金项目] 国家自然科学基金项目（81173657）
[通信作者] 李旭，硕士研究生，Tel：（010）68933254，E-mail：lixu.go@163.com
[作者简介] 刘庆山，副研究员，硕士生导师，研究方向为药理学与创新药物发现，Tel：（010）68933254，E-mail： nlqsh@163.com
神经干细胞（neural stem cells，NSCs）是指具有能分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞能力，可以自我更新并提供大量脑组织的细胞群。NSCs起源于多潜能干细胞，由于在神经系统发育过程中保留下来的自我更新以及多分化潜能的特点，使NSCs移植成为治疗神经系统类疾病的潜在疗法，国内外对此进行了大量研究。目前发现NSCs移植后存在难以存活及定向分化、新生神经元被疤痕组织隔断、易成瘤等问题。寻找调控脑内源性NSCs增殖并定向分化为神经细胞的创新药物是极具前景的研究方向，特别是从我国中药宝库筛选创新药物具有重要现实意义和科学价值。
近年研究表明NSCs在体内外增殖受多种因素的调控，主要包括Notch通路、Wnt通路、Sonic Hedgehog（Shh）通路、表皮生长因子受体（EGFR）、细胞因子等。业已发现各因素在调控NSCs增殖过程中彼此存在交叉，相互作用构成一个复杂的生物分子网络系统，符合中药网络药理学强调的信号通路多途径调节的思想理念，对于分析网络调控的特点，找出网络调控的关键靶点，阐明药物调控网络机制及其系统发病机制，具有极其重要的作用。
中药是我国具有数千年临床应用历史的传统药物，具有多成分、多靶点、多层次，多途径的特征，在防治疾病过程中具有独特的优势，发挥了极其重要的作用。由于中药作用的多效
神经的信号通路(四)
Notch信号通路调控软骨内成骨的研究现状
脊椎动物的骨骼形成是一个复杂的过程。从间充质细胞的富集、体节的形成、软骨内成骨或膜内成骨到骨骼的钙化，软骨细胞、成骨细胞和破骨细胞之间总是存在功能的平衡。软骨内成骨作为骨骼形成的一种主要方式，受多种因素的影响，Notch通路在该过程中起到了极其重要的作用。 1 软骨内成骨
脊椎动物的骨骼发育主要有两种形式：一种是以颅面部骨及锁骨为代表的膜内成骨，还有以中轴骨、四肢骨及颅底骨为代表的软骨内成骨[1]。软骨内成骨发生在胚胎早期，始于间充质细胞的富集，继而形成两种不同的细胞亚群：一个群体形成骨骼生长板，即胚胎发育的一次骨化中心，主要决定了骨的形状；另外一群体则形成骨骺端关节软骨，又被称为二次骨化中心，进一步限定了骨的形状和大小[2]。通常，骨的形状不同，骨化的方式也有所不同，如：四肢的长骨为二次骨化形式，而椎骨则为一次骨化形成。颅底软骨的形成及骨化类似于四肢骨，以生长板形式进行。
在间充质细胞富集区，中心区域的细胞终止增殖，进入分化，经过前肥大细胞、肥大细胞、终末肥大细胞最终分化为肥大成熟的软骨细胞，分泌矿化的细胞外基质即形成软骨，为下一步的骨化提供模板。软骨由一层成纤维细胞样细胞包裹，后者被称为软骨膜。当间充质细胞分化到肥大细胞阶段，软骨膜内的细胞开始分化为成骨细胞，同时软骨膜开始转变为血管丰富的骨膜，血管进入软骨基质中，成骨和破骨细胞通过血管分布到软骨基质，开始破坏软骨基质同时分泌骨基质，形成松质骨，存留在骨膜中的成骨细胞则分泌高度钙化的基质形成皮质骨[1]。
2 Notch信号通路
胚胎软骨发育受复杂多变的信号通路综合调节，从现有知识体系来看，主要包括Ihh、BMP、FGF、Wnt、Notch等信号通路[1]。其中，Notch通路通过调节胚胎期干细胞的增殖、分化与凋亡过程，参与调控哺乳动物胚胎体节发生[3]、胚胎神经系统及消化系统的发育[4]，并在肿瘤的发生过程中扮演了重要的角色，现在已成为肿瘤治疗研究的新靶点[5]。近年来，研究者们开始关注该通路在骨发育过程中的作用。Notch基因最初在果蝇体内发现[6]，随后众多的研究证明其广泛存在且高度保守。在哺乳动物，Notch受体包括Notch1-4四种，配体主要有Delta-like1、3、4和Jagged1、2共五种。作为一种跨膜蛋白受体，Notch配体首先在内质网中转录翻译形成初级蛋白并被运输到高尔基体，其中的蛋白转化酶（protein convertases）在Notch1初级蛋白S1位点进行剪切，随后糖基化转移酶（glycosyltransferases）对其进行不同的糖基化修饰，从而影响配体和受体结合后的不同反应[6]。Notch与相邻细胞上的配体结合后，膜旁负性调节区域（juxtamembrane negative control region，NRR）展开，α-secretase识别该区域并在S2位点剪切掉Notch的胞外段，随后γ-secretase在胞内段S3位点的剪切最终产生胞内片段NICD。NICD直接进入细胞核内，与CSL（DNA结合蛋白，不同种属中名称不同）结合，然后募集Maml（NICD的共同激活因子）、结合组蛋白乙酰化酶和核染色质改建复合物等形成复合体，解除CSL对目标基因的转录抑制作用，并最终产生生物学效应[7]。
3 Notch信号通路对软骨内成骨的影响
3.1体内试验：胚胎12.5天（E12.5）的小鼠前肢芽区开始出现成软骨祖细胞的聚集，此时整个干细胞聚集区都呈现Notch1阳性信号，而到16.5天（E16.5），软骨分化成熟时，Notch1阳性细胞只分布于软骨的边缘区域[8]。这提示其可能参与调控软骨内成骨全过程。进一步的模型动物研究表明：Notch过表达（Gain of function）的小鼠总体表现出圆头短吻、胸廓小、躯干及尾部短的特点，阿辛蓝-茜素红染色显示整体软骨发育不全，通过软骨内成骨方式形成的骨普遍体积较小且长度不足，肢端几乎没有骨化中心存在，且这种转基因小鼠均为胚胎期致死[9-10]。也有研究者通过过表达配体激活内源性Notch通路，进一步观察软骨内成骨过程的变化。研究发现，在鸡胚上肢区域用逆转录病毒过表达Del-1后，早期上肢的发育形态并无改变，而在胚胎7天以后，大小上的差异逐渐明显起来，肢端出现畸形。值得注意的是，Notch通路的配体在脊椎动物有五种，其中一种配体的升高并不能全面解释经典Notch通路在软骨发育中的作用[11]。因为不同配体的表达具有阶段性，故以不同配体过表达方式进行研究有利于揭示Notch通路在骨发育不同阶段的影响。这一方面的研究值得进一步深入。同时，因为Notch通路在胚胎的各个系统发育，尤其是神经系统发育中有重要的作用，因此，全身敲除Notch导致胚胎早期致死，无法进行后续研究，而条件性基因敲除策略或许可以避免这一缺点，为后续的骨发育研究创造条件。
3.2体外实验：间充质干细胞、胚胎肢芽微聚体等原代细胞有向软骨细胞分化的潜能，常被用于软骨分化机制的研究。ATDC5细胞系（小鼠畸胎瘤成纤维细胞系）在胰岛素的诱导下发生软骨向分化[12]。ATDC5细胞在诱导早期即开始表达Notch1和相应的配体Del1[8]，这种表达的时间模式与原代细胞的培养结果相似，也类似于体内试验中动物早期干细胞富集区Notch1的表达模式[8]。运用该体外模型，有利于探索Notch信号通路对软骨向分化调控的机制。首先，Notch通路的激活有利于细胞的增殖：在配体Del的激活Notch信号通路的情况下，小鼠间神经嵴细胞克隆的直径明显增大，细胞数目显著增加[13]。其次，在促进细胞增殖的同时，Notch也可调控体外培养细胞的软骨向分化能力。与高表达Del1的D10细胞共培养时，ATDC5细胞软骨结节及细胞外基质形成明显减少[8]；相反，通过DAPT（γ蛋白酶阻断剂）阻断Notch通路后，肢芽微聚体及间充质干细胞中NICD量明显下降，软骨向分化能力增强，表现为软骨结节的表达增多[14-15]；实验从正反两方面说明，Notch信号通路的激活能维持细胞系的增殖潜能，抑制软骨向分化。值得注意的是ATDC5细胞系软骨源性的细胞系，并非多能干细胞。 同样，利用JAG1过表达的质粒使hMSC的Notch通路持续激活，则细胞会维持在聚合体状态，不再继续分化为成熟的圆形肥大细胞[2]。有趣的是，在小鼠神经嵴细胞成软骨诱导初始即刻添加Delta-Fc，软骨结节更丰富，24h后再添加相同剂量Delta-Fc，成软骨情况不会改善[13]。两种相反的实验结果表明了Notch通路作用时间及细胞所处分化阶段的重要性。最新的研究对Notch表达时期的重要性进行了探索，Rachel等利用人间充质干细胞3D聚体培养进行成软骨向诱导，发现Notch通路配体Jag-1及目标基因Hey-1的表达从诱导开始便急剧上升，并在第2天到达最高值，之后迅速下降，在表达下降后，才开始出现软骨分化标志物Col-II的上升。利用DAPT早期阻断Notch通路可有效降低软骨形成，同时若诱导后期Jag-1过表达持续激活Notch通路，则软骨的形成受到抑制。Notch通路的早期激活开启了干细胞的软骨向分化，但在分化后期持续表达却能抑制进一步分化进行，从而维持前体细胞状态[16]。目前，对Notch通路调节细胞凋亡作用的研究主要集中在肿瘤发生发展领域，Notch通路能够抑制肿瘤细胞的凋亡，现已成为肿瘤治疗的新靶点[17]。而 Notch通路对ATDC5凋亡影响的初步研究表明其对凋亡没有明显影响[8]。
综上所述，体内外实验研究表明，Notch能够促进细胞的增殖，启动早期分化，维持前体细胞的干性，抑制细胞的进一步分化成熟，与软骨内成骨过程密切相关。
4 Notch通路与其他通路的相互作用
作为一条高度保守的重要通路，Notch通路调节各个系统的生长发育，只依靠自身有限的受体配体作用，不足以解释其控制发育过程的复杂性，因此通路之间的相互调节共同作用也是十分重要的。在软骨发育中，主要的调节通路包括Sox9、BMP、FGF等可能与Notch通路有交互作用。有研究表明，Jag1通过激活Notch通路抑制Sox9的表达，另一方面，Notch也直接抑制Sox9的目的基因，两条途径共同作用抑制hMSC的软骨向分化[16]。另外，研究发现FGF2能促进小鼠MSC成软骨向分化，阻断Notch通路后，其促进成软骨向分化能力减弱，表现为Col-II表达减少，而利用SU5402阻断FGF通路后，Del-Fc激活Notch通路可部分解除对Col-II的表达抑制，这说明FGF2的部分功能可以通过Notch通路行使[13]。再者，DAPT处理细胞抑制Notch通路后，BMP4表达未受影响，但相应的下游蛋白Id1表达却有了相当的升高，这可能是由于BMP4位于Notch上游并通过其抑制成软骨向分化过程[14]。很多证据表明Notch在影响软骨分化的过程中与其他通路有着密切的联系和相互作用，这是一个复杂而精细的调控网络，具体的机制还有待进一步探讨。
5 结论
软骨内成骨过程中，Notch通路作用的细胞及分子生物学机制是非常复杂的，不同时期配体的调控、与其他通路的相互作用等在Notch行使功能时扮演了重要角色。越来越多的研究表明，Notch通路在控制干细胞的增殖和软骨向分化、维持细胞的干细胞活性、保持基质的平衡方面起了重要的作用，而其中的具体机制仍有待探索。深入研究Notch通路对软骨内成骨的影响有利于人们进一步理解生命发展过程，为各种先天性骨、软骨发育不全等骨畸形的预防性诊断及治疗开辟途径。
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编辑/李阳利
http://m.zhuodaoren.com/shenghuo334934/
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